河野脂螨发育各阶段外部形态扫描电镜观察

【目的】了解河野脂螨Lardoglyphus konoi各发育阶段外部形态和超微结构特征。【方法】利用室内培养获得的不同发育阶段的河野脂螨个体样本,在扫描电镜下观察各发育阶段(卵、幼螨、若螨和成螨)的外部形态和超微结构。【结果】河野脂螨卵呈椭圆形;幼螨足3对,未见生殖器官生长痕迹,生殖毛和肛毛缺如;若螨足4对,生殖器官发育不完全,有生殖毛和肛毛,但发育亦不完全。休眠体前端尖细,后端钝圆,呈梨形状。在末体区有吸盘板,其上有13个吸盘,呈2-2-4-5分布。成螨螯肢细长,剪刀状,其上的定趾和动趾上有几个小齿;顶外毛长度约为顶内毛的50%,与顶内毛处同一水平线上。雄成螨第3对足的跗节末端为2个粗钝的齿所替代;腹面有1个生殖区和带有1对肛门吸盘的肛区。雌成螨所有的爪均分叉;腹面生殖孔为1个纵向裂缝;肛门不伸达后缘。【结论】通过电镜扫描对河野脂螨不同发育阶段外部形态和超微结构的观察,更加详细地了解了该螨的形态结构,从而为脂螨科螨类的分类和生物学研究提供了理论依据。     

荻草谷网蚜唾液蛋白基因Sm13498的克隆及功能分析

【目的】荻草谷网蚜Sitobion miscanthi为我国小麦Triticum aestivum主产区麦蚜优势种;Sm13498蛋白是在荻草谷网蚜唾液腺中特异表达的唾液蛋白。本研究旨在探析荻草谷网蚜功能未知的Sm13498在调节植物防御反应中的潜在作用。【方法】基于荻草谷网蚜唾液腺转录组测序数据,PCR克隆Sm13498的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;采用RT-qPCR测定Sm13498在取食小麦叶片不同时间的荻草谷网蚜无翅成蚜中的表达动态;通过酵母分泌系统验证Sm13498蛋白信号肽的分泌功能;利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导在本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达技术鉴定Sm13498蛋白功能及亚细胞定位。【结果】克隆获得了荻草谷网蚜Sm13498 cDNA全长序列(GenBank登录号：MW346655),开放阅读框(ORF)全长783 bp,编码260个氨基酸,预测蛋白分子量28.01 kD,第1-22位氨基酸为N端信号肽。系统进化树显示,Sm13498与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的功能未知蛋白LOC100159087precursor(GenBank登录号: NP_001313548.1)亲缘关系最近(氨基酸序列一致性为71.7%)。RT-qPCR结果表明,Sm13498在荻草谷网蚜无翅成蚜取食小麦叶片12 h时表达水平达到最高。含有Sm13498信号肽片段的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YTK12可在YPRAA培养基正常生长,并可将无色2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)还原为不可溶的暗红色的氯化三苯基四氮唑(TTF),证实其信号肽具有分泌活性。经根癌农杆菌介导在本氏烟瞬时表达Sm13498蛋白可抑制Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein, BAX)及病原菌激发子INF1诱导的程序性细胞死亡。亚细胞定位结果表明,Sm13498-GFP融合蛋白定位于本氏烟叶片细胞膜。【结论】结果说明荻草谷网蚜唾液蛋白Sm13498可抑制植物防御反应。本研究为发掘荻草谷网蚜唾液中效应子, 深入解析麦蚜对小麦品种强适应性奠定了基础。     

营养对褐飞虱生长和繁殖信号通路的影响

【目的】昆虫感知外界营养状态,在体内营养信号通过许多信号通路进行传递,进而调控昆虫的生长和繁殖。本研究旨在为营养调控褐飞虱Nilaparvata lugens生长和繁殖的分子机制作出初步探索。【方法】在不同营养条件［100%浓度饲料(全纯人工饲料D-97, 对照)、50%浓度人工饲料和25%浓度人工饲料］下饲喂褐飞虱3龄第2天若虫至成虫,统计体重、发育历期、存活率和每卵巢成熟卵量;利用荧光定量PCR检测羽化后第2天褐飞虱成虫不同组织(卵巢、脂肪体和其他组织)中IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因(InR1, InR2, AKT, FoxO, TOR, S6K, 4EBP, AMPKα,AMPKβ和AMPKγ)的表达量;利用Western blot方法检测羽化后第6天褐飞虱成虫卵巢和其他组织中Akt, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平;同时检测羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平以及不同龄期褐飞虱体内保幼激素(juvenile hormone, JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)滴度。【结果】与饲喂100%浓度人工饲料的对照相比,用低浓度人工饲料饲喂褐飞虱至成虫导致5龄第2天至成虫体重显著降低,从3龄第2天若虫至成虫发育历期缩短,死亡率提高,每卵巢成熟卵量显著降低。取食低浓度人工饲料后,羽化后第2天成虫IIS, TOR以及AMPK信号通路相关基因InR2, TOR, 4EBP, AMPKα在卵巢、脂肪体和其他组织中, AKT, S6K和AMPKγ在脂肪体和其他组织中,以及InR1, FoxO和AMPKβ在其他组织中表达量较对照均显著下降,但卵巢中InR1, AKT, FoxO和AMPKγ的表达量相对稳定;羽化后第6天成虫卵巢和其他组织中AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平显著增加。随着人工饲料饲喂浓度的降低,羽化后第6天褐飞虱成虫不同组织中的ROS水平显著增加。不同营养条件下褐飞虱4龄第2天若虫体内JH滴度无显著差异,低营养条件下5龄第2天若虫体内JH滴度较对照显著降低,而在羽化后第2天成虫体内JH滴度则较对照显著增加;低营养条件导致褐飞虱若虫以及成虫体内20E滴度均显著增加。【结论】褐飞虱在面临营养缺失的情况下,营养信号传导通路(IIS, TOR以及APMK通路)的关键基因表达均下降,而ROS水平显著上升,通过调节AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平,进而影响JH以及20E的生物合成。     

桃蛀螟气味结合蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的基因克隆、原核表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在明确气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)在桃蛀螟Conogethespunctiferalis化学感受过程中的生理功能,为以OBPs蛋白为防治靶标的桃蛀螟绿色防控提供理论依据。【方法】基于前期桃蛀螟触角转录组测序数据,利用PCR技术从桃蛀螟触角中获得桃蛀螟气味结合蛋白基因CpunOBP3和CpunOBP4的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4,原核表达并纯化获得重组目的蛋白CpunOBP3和CpunOBP4;最后利用荧光竞争结合实验测定了重组蛋白CpunOBP3和CpunOBP4对24种配体的结合能力。【结果】克隆获得桃蛀螟气味结合蛋白基因CpunOBP3(GenBank登录号: GEDO010000010.1),开放阅读框全长387 bp,编码128个氨基酸,预测分子量大小为14.72 kD;CpunOBP4(GenBank登录号: GEDO010000011.1)开放阅读框全长438 bp,编码145个氨基酸,去除信号肽的CpunOBP4蛋白预测分子量大小为12.82 kD。CpunOBP3和CpunOBP4均具有OBPs的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸残基。CpunOBP3和CpunOBP4重组蛋白均以包涵体形式存在。荧光竞争结合实验发现,CpunOBP3重组蛋白能与测试的7种植物挥发物有效结合,尤其与3-蒈烯的结合能力最强,解离常数K_i值为10.33 μmol/L,但不能与测试的2种桃蛀螟性信息素有效结合;而CpunOBP4重组蛋白既可以与测试的2种性信息素(顺-10-十六碳烯醛和十六醛)结合(解离常数K_i值分别为14.65 μmol/L和7.83 μmol/L),又可以与测试的8种植物挥发物有效结合,尤其与丁酸乙酯的结合能力最强,解离常数K_i值为4.32 μmol/L。【结论】根据这些结果,我们推测CpunOBP3主要在桃蛀螟寄主定位与寄主转移过程中发挥重要作用,而CpunOBP4在桃蛀螟识别性信息素和寄主植物挥发物过程中发挥双重作用。研究结果为利用干扰桃蛀螟嗅觉感受从而调控其发生与危害提供了理论依据。     

低温对麦红吸浆虫滞育解除及蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90表达水平的影响

【目的】本研究旨在明确破茧率和破茧所需时间作为典型的专性幼虫期滞育昆虫麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育解除指标的可行性,探讨蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90在低温解除滞育中的作用。【方法】9月上旬采自田间的麦红吸浆虫滞育幼虫在低温(4℃)和自然变温处理不同时间(0~90 d)后转移至24℃化蛹,调查幼虫的破茧率、化蛹率及破茧和化蛹所需时间;采用qPCR技术分析4℃低温终止滞育并在24℃下恢复发育的幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的mRNA水平。【结果】不同时间低温(4℃)和自然变温处理的麦红吸浆虫滞育幼虫破茧率和化蛹率以及破茧和化蛹所需时间均存在显著差异。未经低温(4℃)处理的幼虫在水分满足的条件下破茧率为71.3%,但均不能化蛹;低温(4℃)处理60 d内,随着处理时间的延长破茧率和化蛹率逐渐升高,破茧和化蛹所需时间逐渐缩短;与4℃低温处理30~60 d相比,自然变温处理30~60 d的幼虫化蛹率显著较低;4℃低温处理60 d和自然变温处理90 d后幼虫的化蛹率均超过91%。低温(4℃)处理显著提高了麦红吸浆虫幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的表达量,其中处理30 d时其表达量最高,随着低温(4℃)处理时间的延长,表达量逐渐降低,大部分幼虫滞育解除后表达量趋于恒定。【结论】低温能显著促进麦红吸浆虫的滞育解除,效果优于9-10月自然变温;破茧率及破茧所需时间可作为评判麦红吸浆虫幼虫滞育强度的参考,但不能独立作为滞育解除的指标;EcR,Hsp70和Hsp90的表达水平与滞育强度密切相关,在麦红吸浆虫滞育解除中发挥潜在作用。     

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的功能奠定基础。【方法】运用RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾SfTPS的全长编码区,并进行生物信息学分析。运用RT-qPCR技术检测SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(体壁、中肠和脂肪体)中和经短期(2, 4和8 h)高(35℃)低温(10℃)胁迫后5龄幼虫中的表达变化。【结果】克隆获得2 571 bp的草地贪夜蛾TPS cDNA序列,命名为SfTPS(GenBank登录号： MT920672),全长开放阅读框(ORF)长2 481 bp,编码的826个氨基酸具有TPS和TPP两个保守结构域。同源比对和系统进化分析表明,昆虫TPS蛋白具有较高的保守性,SfTPS与斜纹夜蛾S. litura的TPS亲缘关系最近,序列一致性达到99.15%。SfTPS中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲占比分别为38.14%, 12.23%和48.55%;SfTPS的三级结构为同源二聚体。RT-qPCR结果表明,SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期低表达,在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达,且草地贪夜蛾变态前后SfTPS的表达量变化较大。组织分布结果显示,SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达量最高。草地贪夜蛾5龄幼虫经2~8 h低温(10℃)和高温(35℃)胁迫后,SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃),分别为对照的4.43~9.34和2.50~6.03倍。【结论】SfTPS基因在草地贪夜蛾生长发育过程及抵御高低温度胁迫中可能具有重要作用。     

利用CRISPR/Cas9系统检测果蝇细胞中组蛋白甲基化修饰对20E信号传导的调控

【目的】利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20 羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)信号传导的调控。【方法】通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点;将5个组蛋白甲基转移酶基因［trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg］的sgRNA插入到敲除载体pAc-sgRNA-Cas9骨架中并转染黑腹果蝇Kc细胞,利用TA克隆和测序鉴定突变位点。以Trr正调控20E初级应答基因Br-C的转录表达为阳性对照,利用qRT-PCR和Western blot检测该系统敲除靶基因的有效性;通过检测20E应答元件(20E response element, EcRE)双荧光素酶活性确定trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg是否参与20E信号传导。【结果】果蝇组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白H3的赖氨酸残基上,H3的精氨酸残基和组蛋白H4的甲基化修饰较少。trr敲除载体pAc-trr-sgRNA-Cas9转染Kc细胞后成功突变trr,降低H3K4三甲基化水平并阻断20E对其初级应答基因Br-C的转录诱导,证明该敲除系统的有效性。除trr之外,Mes-4和egg的敲除降低EcRE的双荧光素酶活性。【结论】插入靶标基因sgRNA序列的pAc-sgRNA-Cas9敲除载体在果蝇Kc细胞中可以有效快捷地突变靶基因。利用该敲除系统发现,除Trr之外,Mes-4和egg影响EcRE的活性而参与20E信号传导。本研究为昆虫细胞CRISPR/Cas9介导的基因敲除和组蛋白甲基化修饰调控20E信号传导的深入研究提供了理论依据与工作基础。     

柞蚕微粒子病潜在生物标志物的挖掘

【目的】挖掘柞蚕Antheraea pernyi微粒子病的潜在生物标志物,为开发该病害检测方法及研究柞蚕被微孢子虫Nosema pernyi侵染后体内代谢产物的差异及功能奠定基础。【方法】利用高效液相色谱和高分辨率质谱进行非靶向代谢组学分析,调查健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中代谢物差异。【结果】正离子模式下从健康和患微粒子病柞蚕雌成虫血淋巴中共获得8 870个代谢物,注释代谢物5 390个,筛选到差异表达代谢物472个(上调260个,下调212个),其中二级鉴定差异表达代谢物12个(上调8个,下调4个);负离子模式下获得6 716个代谢物,注释代谢物3 848个,筛选到差异表达代谢物301个(上调207个,下调94个),其中二级鉴定差异表达代谢物9个(上调8个,下调1个)。正离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括缬氨酸(valine)、苯并噻唑(benzothiazole)、3-脱羟基肉碱(3-dehydroxycarnitine)、1 甲基鸟嘌呤(1-methylguanine)、2-乙氧基萘(2-ethoxynaphthalene)、N6-乙酰基-L-赖氨酸(N6-acetyl-L-lysine)、生物素(biotin)、桑色素(morin)、噻吗洛尔(timolol)、酰基肉碱15∶0(acylcarnitine 15∶0)、酰基肉碱18∶4(acylcarnitine 18∶4)和异槲皮苷(isoquercitrin);负离子模式下二级鉴定的差异表达代谢物包括二甲基丙二酸(dimethylmalonic acid)、戊二酸(glutaric acid)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)、1,3-二乙酰基丙烷(1,3-diacetylpropane)、3-(4-羟基苯基)乳酸(DL-p-hydroxyphenyllactic acid)、泛酸(pantothenate)、荧光素(fluorescein)、飞燕草素-3-O-beta-吡喃葡萄糖苷(delphinidin-3-O-beta-glucopyranoside)和溶血磷酯酰肌醇16∶1 (lysoPI 16∶1)。【结论】健康与患柞蚕微粒子病的柞蚕雌成虫血淋巴内代谢物具有显著差异,通过代谢组学挖掘出21个二级鉴定的差异表达代谢物,这些代谢物可作为潜在生物标志物用于开发柞蚕微粒子病的检测方法。     

基于F3Net显著性目标检测的蝴蝶图像前背景自动分割

【目的】具有复杂背景的蝴蝶图像前背景分割难度大。本研究旨在探索基于深度学习显著性目标检测的蝴蝶图像自动分割方法。【方法】应用DUTS-TR数据集训练F³Net显著性目标检测算法构建前背景预测模型,然后将模型用于具有复杂背景的蝴蝶图像数据集实现蝴蝶前背景自动分割。在此基础上,采用迁移学习方法,保持ResNet骨架不变,利用蝴蝶图像及其前景蒙板数据,使用交叉特征模块、级联反馈解码器和像素感知损失方法重新训练优化模型参数,得到更优的自动分割模型。同时,将其他5种基于深度学习显著性检测算法也用于自动分割,并比较了这些算法和F³Net算法的性能。【结果】所有算法均获得了很好的蝴蝶图像前背景分割效果,其中,F³Net是更优的算法,其7个指标S测度、E测度、F测度、平均绝对误差(MAE)、精度、召回率和平均IoU值分别为0.940, 0.945, 0.938, 0.024, 0.929,0.978和0.909。迁移学习则进一步提升了F³Net的上述指标值,分别为0.961, 0.964, 0.963, 0.013, 0.965, 0.967和0.938。【结论】研究结果证明结合迁移学习的F³Net算法是其中最优的分割方法。本研究提出的方法可用于野外调查中拍摄的昆虫图像的自动分割,并拓展了显著性目标检测方法的应用范围。     

家蚕抗真菌因子BmSPI39对球孢白僵菌入侵的表达响应

【目的】制备家蚕Bombyx mori抗真菌因子BmSPI39的多克隆抗体,分析BmSPI39对球孢白僵菌Beauveria bassiana入侵的表达响应。【方法】利用原核表达和固定化镍离子亲和层析技术获得高纯度的BmSPI39重组蛋白,利用胶内活性染色检测重组蛋白BmSPI39对枯草杆菌Bacillus subtilis蛋白酶A的抑制活性;利用重组蛋白BmSPI39,通过免疫新西兰大白兔制备BmSPI39的多克隆抗体。基于家蚕开放性数据库SilkDB 3.0,分析BmSPI39在4龄第3天至化蛹后1 d家蚕免疫相关组织体壁、中肠和脂肪体中的时空表达特征。利用制备的BmSPI39抗体通过Western blot分析感染球孢白僵菌不同时间后家蚕幼虫和蛹体壁中BmSPI39应答球孢白僵菌入侵的表达响应。【结果】胶内活性染色结果显示,重组BmSPI39蛋白能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶A的活性。酶联免疫吸附结果显示,BmSPI39抗血清的抗体效价达1∶128 000。Western blot和胶内活性染色结果显示,纯化后的BmSPI39抗体能够有效结合不同多聚体化状态下的BmSPI39抗原蛋白。BmSPI39表达数据的热图分析显示,BmSPI39在游走期和预蛹期的家蚕体壁中有表达,在预蛹期的脂肪体中的表达量较高,但在各发育阶段的中肠中均不表达。Western blot分析结果表明,家蚕幼虫体壁中的BmSPI39的表达在感染球孢白僵菌后84 h上调表达,108和120 h下调表达。【结论】本研究成功制备了BmSPI39的多克隆抗体。BmSPI39蛋白的表达能够响应球孢白僵菌入侵,可能参与蛹期家蚕抵御真菌入侵的过程。